动物胚胎的发育是十分复杂动态的过程，在发育生物学中也长期存在一个重要的研究领域：一个有着头尾轴、背腹轴和左右不对称特征的生物体究竟是如何由均一的受精卵发育而来？2005年，为纪念创刊125周年，《Science》期刊发布了125个重要的未知科学问题，其中就包含述胚胎建立不对称性的机制。近年来。围绕这一问题，世界范围内的科学家也做出了许多的努力，逐步揭示从受精卵到卵裂球到囊胚等阶段建立不对称性的机械和生物机制，但胚胎到了越往后的发育阶段就越复杂，也更难以在体外进行深入探究。

左右不对称在自然界中其实非常常见，比如招潮蟹和枪虾就有着左右大小各异的两个钳子，而大多数的脊椎动物就身体内各种器官分布而言也都是较为不对称的（比如心脏总是在胸腔左侧、大脑也分为不同结构和功能的左右脑）。胚胎发育过程中如果发生左右不对称缺陷，会带来非常严重的后果，内脏异位就是一类典型的发育不对称性缺陷疾病，其以随机的内脏左右分布为特征，先天性心脏病的发病率在内脏异位的群体中也大幅增加，尤其是大动脉移位和室间隔缺陷。因此，对于胚胎左右不对称发育的机制进行深入了解对于调节胚胎发育和预防治疗发育缺陷类疾病具有重要意义。

图 1 自然界中具有典型左右不对称性的招潮蟹和枪虾

2023年01月05日，来自日本理研生物系统动力学研究中心的Hiroshi Hamada教授与来自美国哈佛医学院的Shiaulou Yuan教授背靠背在国际顶级期刊《Science》期刊发表文章，共同深入揭示胚胎发育过程中建立左右轴及不对称性的机制。研究内容分别以“Immotile cilia mechanically sense the direction of fluid flow for left-right determination”和“Cilia function as calcium-mediated mechanosensors that instruct left-right asymmetry”为题于发表于《Science》。

文章1 纤毛机械感知流动方向以确定左右轴向

研究首先探究了体内不动纤毛对淋巴结流动的反应，通过高速实时荧光成像发现节流导致左侧和右侧纤毛频繁的小弯曲运动，表明该运动为连续的时间无关运动，而非双边等周期运动，从而有助于L-R对称性的破除。为了验证不动纤毛是否响应于节流而发生稳态变形，研究比较了有无节流时相同纤毛的形状。节点处的活动纤毛通过UV照射固定，并在这种照射前后通过高分辨率显微镜观察到已固定纤毛的形状。粒子图像测速（PIV）分析表明，在UV照射45秒后，节点流完全消失。此外，通过对UV照射前后相同纤毛形状的椭球拟合可以估算不动纤毛的流动相关弯曲角。

图2 小鼠胚胎节处的不动纤毛沿D-V轴对节流的反应发生不对称变形

研究对两体节阶段的胚胎不动纤毛进行了弯曲角度的分析，发现左侧的纤毛向腹侧弯曲5.0°±9.2°，而右侧的纤毛向背侧弯曲4.2°±7.4°，存在较大差异，这主要取决于向左侧流动的存在，且与胚胎阶段有关。因此，当节流速度最大时，弯曲角在两个和三个体节阶段沿着背腹（D-V）轴显著不对称，而当流动缺失或较弱时，弯曲角度在晚头褶（LHF）和零体节阶段不表现出不对称。基于体内观察对血流进行建模表明，在淋巴结的左后方区域存在腹向血流，在淋巴节的右侧存在背向血流。并且，在淋巴结的左后部区域优先观察到了腹侧弯曲程度最大的不动纤毛，其中腹侧定向流动突出，出现了第一个分子不对称性。

接下来，研究者们用光镊测试了淋巴结处不动纤毛是否会响应于机械力，该机械刺激测试是在模拟早期头褶（EHF）阶段至三体节阶段iv/iv胚胎（缺乏节流）单个不动纤毛的节流的条件下进行的，具体而言，就是将光学镊子捕获的聚苯乙烯珠（D = 3.5μm）与纤毛接触，并进行背腹轴微运动。对不动纤毛施加机械刺激1.5小时后，所有冠细胞进行两次均匀光漂白，每次漂白后恢复时间为30分钟，通过延时3D成像监测具有受刺激纤毛的细胞和相邻未受刺激纤毛细胞中dsVenus荧光的恢复，发现受刺激细胞中的荧光恢复程度显著低于未受刺激细胞，这表明不动纤毛的机械刺激能够诱导Dand5 mRNA的降解。此外，研究发现在缺乏阳离子通道Pkd2的胚胎中，其对机械刺激的反应丧失，从而表明不动纤毛的机械刺激以Pkd2依赖的方式诱导Dand5 mRNA的降解。

图3 通过光镊对纤毛进行机械刺激可触发Dand5mRNA降解并增加Nodal活性

此外，研究者们还探究了不动纤毛是否会对朝向背侧或腹侧的强制弯曲做出不同的反应，推测这以反应可能是由于纤毛内的结构或分子能够感知弯曲方向所导致的。这种结构或分子相对于胚胎中线的极化分布将使得其能够对节流方向产生不同的响应。但聚焦离子束扫描电子显微镜实验并没有在不动纤毛底部或附近找到这样的目标结构，并且使用光学镊子测量不动纤毛的弯曲刚度表明，背侧弯曲和腹侧弯曲之间并没有明显差异。因此，研究认为机械敏感性通道可能优先位于不动纤毛的一侧（背侧或腹侧），其中最优可能的就是Pkd2。研究通过3D受激发射耗尽（STED）显微镜分析了转基因的野生型胚胎中Pkd2在不动纤毛内的精确定位，发现每个不动纤毛上Pkd2::Venus蛋白存在不均匀分布，它们总是积累在不动纤毛表面形成簇，且优先位于胚胎左侧和右侧的背侧，通过Airyscan检测器表征和高斯拟合进一步证实了该结果。

图4 不动纤毛以依赖于PKD2极化定位的方式感知弯曲方向

文章2 纤毛作为钙离子介导的机械感受器指示左右不对称

这篇工作则是设计了一种新型策略，即使用光学镊子将局部机械力施加到纤毛上，他们通过使用光学镊子通过直接捕获纤毛并施加力来弯曲纤毛，并将光镊和荧光显微镜集成在定制的仪器中，从而允许使用纤毛靶向荧光钙离子报告器进行同时记录。研究在LLC-PK1猪肾上皮细胞上验证了这一纤毛偏转方法，通过将激光聚焦到野生型（WT）LLC-PK1细胞的纤毛上来捕获纤毛的远端，并通过使用压电致动反射镜操纵捕获激光来机械弯曲纤毛，发现所有偏转参数（频率、位移、角度、方向和持续时间）都可被精确和远程控制。为了模拟初级纤毛受到脉动剪切流体流的影响并被其弯曲的生理条件，研究进一步将光学镊子编程为以定义的弯曲频率向纤毛施加振荡偏转模式，用荧光纤毛标记物转基因arl13b:EGFP（20）转染LLC-PK1细胞，也实现了对光学振荡弯曲和荧光信号分布的同时验证。

图5 用于纤毛力学研究的精确可调平台CiliaSPOT

为了方便斑马鱼LR发育过程中纤毛内钙信号和纤毛偏转研究的同时实时成像，研究继续构建了一个带有光学镊子的定制纤毛选择性平面照明显微镜（CiliaSPOT），并通过CiliaSPOT确定了LRO（left-right organizer）中的由活动纤毛驱动的定向流体流动与髂内钙振荡（ICO）之间的机制联系。为了确定ICO是否是在LRO纤毛中机械产生的，CiliaSPOT用于在没有内源性流体流动的情况下偏转斑马鱼的不动LRO纤毛。平均来说，在34.2±3.5次弯曲后会发生髂内钙瞬变，位移为2.4±0.2μm，偏转角为31.7±2.5°。所有的纤毛，无论其在LRO内的位置如何，都可以通过髂内钙离子瞬变响应CiliaSPOT偏转，这一结果表明内源性左侧LRO ICO是响应于定向LRO流动施加的力而产生的。此外，研究发现LRO纤毛CiliaSPOT弯曲引起的钙离子瞬变在空间上并不是自主的，因为钙离子瞬变通常扩散到细胞体、相邻的LRO细胞和LRO周围的肠系膜组织。

图6 LRO纤毛上的振荡机械刺激激活髂内钙离子瞬变

Pkd2定位于所有LRO纤毛，对LRO中的左侧ICO和正常LR模式至关重要，但关于Pkd2是否在广泛的组织中作为纤毛状钙离子通道和机械传感器发挥作用，目前说法并不统一。为了解决Pkd2在LRO中的功能，研究利用CiliaSPOT对Pkd2突变体和敲除斑马鱼胚胎的LRO中纤毛进行机械弯曲，并测量纤毛内钙离子水平。结果发现在pkd2敲除和pkd2敲减胚胎的不动LRO纤毛中，CiliaSPOT诱导的髂内钙离子瞬变发生率显著降低，此外，在pkd2突变体胚胎中，LRO纤毛状体弯曲后胞浆钙离子活性没有升高。同时，光钳处理的pkd2突变体胚胎中髂内钙瞬变的损失表明CiliaSPOT诱导的WT和c21orf59敲除胚胎中的髂内钙离子瞬态不是由光损伤或微损伤引起的，这些结果证实Pkd2具有作为LRO中纤毛上的机械敏感性钙离子通道的作用。

图7 纤毛机械感知是LR不对称的必要条件

最后，研究进一步研究了在心脏LR模式形成期间是否需要Pkd2进行纤毛状体机械感受器的存在，这些胚胎也具有LR随机化的心脏循环和慢运动。与c21orf59胚胎相比，pkd2敲除胚胎左侧弯曲不动纤毛1小时并不能挽救正确的左心慢速，从而证实pkd2作为LRO纤毛确定心脏位置所需的机械传感器的关键作用，以上这些研究结果综合确立了纤毛状机械感知对于LR不对称的必要性、充分性和指导性。

总结与展望

在大多数脊椎动物中，在早期胚胎发育过程中，左右差异是由一个称为左右组织器的小细胞簇确定的，其中活动的纤毛快速移动以产生细胞外液的向左流动，这是左右差异的第一个迹象，但这种流动是如何被感知并转化为后来的分子和解剖学上的左右不对称的目前仍不清楚。以上两篇工作中，Hamada等人通过对小鼠胚胎的研究发现，不动纤毛能够感知水流产生的机械力，并提出了一种感知水流方向的生物物理机制。另一边，Yuan等人也在斑马鱼身上进行独立工作，使用光镊和活体成像发现组织器中的不动纤毛可作为机械传感器，将细胞外流体流转化为钙离子信号，当活动纤毛不动且正常血流停止时，外加的机械性操纵纤毛可以挽救甚至逆转胚胎左右轴的取向。这些工作对于未来相关的胚胎发育研究和对称性紊乱疾病的早期治疗具有重要的启示和指导意义。

文章来源：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq8148

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq7317

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